12月04 【成功案例】不同肌內(nèi)脂肪含量的兩種牛中肝臟轉(zhuǎn)錄組研究

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不同肌內(nèi)脂肪含量的兩種牛中肝臟轉(zhuǎn)錄組研究

發(fā)表雜志：Biochemical?and?Biophysical?Research?Communications

影響因子：2.466

PMID：28669724

 

摘要

肌內(nèi)脂肪（IMF）含量是牛肉質(zhì)量的重要決定因素。晉南牛和西門(mén)塔爾牛之間的IMF含量有顯著差異。在這里，為了鑒定與IMF沉積有關(guān)的候選基因和網(wǎng)絡(luò)，研究人員深入探索了這兩種牛中肝臟的轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)。研究人員對(duì)5個(gè)晉南牛和3個(gè)西門(mén)塔爾牛的肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，產(chǎn)生了約4139M?reads。共檢測(cè)到124個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），在晉南牛肉中，有53個(gè)上調(diào)，71個(gè)下調(diào)。?此外，共鑒定了1282個(gè)潛在的新基因。GO分析顯示，這些DEGs（包括CYP21A2，PC，ACACB，APOA1和FADS2）在脂質(zhì)生物合成過(guò)程、膽固醇酯化調(diào)節(jié)、膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)和脂蛋白脂肪酶活性的調(diào)節(jié)中顯著富集。參與丙酮酸代謝途徑的基因也顯著過(guò)表達(dá)。此外，本研究還確定了一個(gè)與脂質(zhì)代謝有關(guān)的相互作用網(wǎng)絡(luò)，這可能是導(dǎo)致牛在基因組中沉積的原因。由此推論，參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的DEGs可能在IMF沉積中起重要作用。綜上所述，研究者提出了一組候選基因和相互作用網(wǎng)絡(luò)，可以與IMF沉積相關(guān)聯(lián)，并用作牛的育種中的生物標(biāo)志物。

 

背景

牛肉是人類食物最重要的蛋白質(zhì)來(lái)源之一。在不同品種的牛之間，生長(zhǎng)速度，肌肉質(zhì)量和肉質(zhì)存在顯著差異。津南黃牛是我國(guó)五大黃牛品種之一，以其肉質(zhì)鮮嫩，紋路鮮明而聞名。相比之下，源自瑞士的西門(mén)塔爾牛是世界上大量喂養(yǎng)的品種，主要用于生產(chǎn)好的乳品或肉質(zhì)的品種，它們的生長(zhǎng)速度較快，瘦肉含量高，以至于肌內(nèi)脂肪（IMF）含量以及嫩度低于晉南牛肉。?IMF含量和肌肉纖維特性是肉品質(zhì)的主要決定因素，包括感官特性（嫩度，多汁性和風(fēng)味）和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。IMF含量與牛肉感官品質(zhì)性狀呈正相關(guān)。西門(mén)塔爾牛和晉南牛的IMF含量差異使其成為比較基因組學(xué)研究的重要材料，用來(lái)研究牛肌內(nèi)脂肪酸沉積的分子機(jī)制。

肝臟與脂肪組織和骨骼肌是哺乳動(dòng)物脂質(zhì)代謝和其他代謝過(guò)程中最重要的器官之一。它是非酯化脂肪酸吸收、氧化和代謝轉(zhuǎn)化的中心器官。此外，它具有從頭脂肪生成，細(xì)胞質(zhì)三酰甘油儲(chǔ)存，從葡萄糖和其他非脂質(zhì)前體合成脂肪酸的酶活性。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，已有對(duì)豬和乳鴿肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究，以探索影響IMF成分的潛在候選基因。日本黑色longissimus?dorsi和荷斯坦黑白花牛轉(zhuǎn)錄組報(bào)告顯示，在日本黑牛中，具有較強(qiáng)IMF沉積能力特征的差異表達(dá)基因中，大多數(shù)表達(dá)上調(diào)。并且鑒定了一個(gè)與細(xì)胞形態(tài)和脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)。然而，并沒(méi)有兩種不同IMF水平的牛肝臟比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。

在該研究中，使用RNA-Seq方法來(lái)分析西門(mén)塔爾牛和津南牛的肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。這項(xiàng)研究的主要目標(biāo)是確定差異表達(dá)的基因和相互作用網(wǎng)絡(luò)，這可能有助于牛的肌內(nèi)脂肪酸組成研究。?另外，該研究鑒定的候選基因可能會(huì)對(duì)牛的分子育種有幫助。

 

材料和方法

為了消除性別差異，該研究全部選擇雄性牛。3頭西門(mén)塔爾和5頭晉南牛，生長(zhǎng)1.5年，屠殺后30分鐘內(nèi)取肝臟組織，在液氮中快速儲(chǔ)存，提取總RNA。

測(cè)序平臺(tái)：北京百邁客生物科技有限公司Illumina?Hiseq?3000平臺(tái)，PE150

分析平臺(tái)：百邁客云科技有限公司（BMKCloud）

分析內(nèi)容：1.低質(zhì)量reads質(zhì)控；

2.參考基因組比對(duì)（Bos?taurus參考基因組，版本UMD?3.1.1）；

3.基因表達(dá)量和差異表達(dá)分析；

4.差異表達(dá)基因的功能富集分析；

5.蛋白質(zhì)互作分析；

 

結(jié)果

1.西門(mén)塔爾牛和晉南牛肝組織RNA測(cè)序結(jié)果

使用Illumina?Hiseq?3000平臺(tái)對(duì)西門(mén)塔爾（n?=?3）和晉南（n?=?5）牛的肝進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。質(zhì)控后共獲得61.33?Gb數(shù)據(jù)，約為牛基因組的23倍。8個(gè)樣本的Q30均大于93％。與參考基因組比對(duì)率均在80.27％-85.48％范圍內(nèi)（表1）。

表1.RNA測(cè)序數(shù)據(jù)和比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.新基因的鑒定和注釋

利用Cufflinks軟件來(lái)鑒定西門(mén)塔爾牛和晉南牛的新基因。該研究中共檢測(cè)到1282個(gè)潛在的新基因。?其中，有1043個(gè)基因通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)（NR，Swiss-Prot，GO，COG，KOG，Pfam和KEGG）比對(duì)進(jìn)行了注釋。?值得關(guān)注的是，在Swiss-Prot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中可以注釋到364個(gè)新基因，這意味著它們是潛在的蛋白質(zhì)編碼基因，在之前的牛參考基因組中沒(méi)有注釋。?此外，?GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中分別注釋548和371個(gè)新基因。

3.差異基因表達(dá)分析

使用DESeq?R軟件包鑒定西門(mén)塔爾牛與晉南牛的差異表達(dá)基因（DEGs）。將Fold?Change≥2且FDR<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共鑒定了124個(gè)顯著的DEGs，其中晉南牛中有53個(gè)（42.7％）上調(diào)，71個(gè)（57.3％）下調(diào)（圖2）。西門(mén)塔爾牛和晉南牛中17個(gè)新基因有顯著差異。一些轉(zhuǎn)錄本在豐度上有很大的差異，如ENSBTAG00000047322（|log2-fold?change|?=?7.16），血紅蛋白亞基beta（HBB，|log2-fold?change|=?3.76）和超氧化物歧化酶1（SOD1，|log2-fold?change?|=?8.38）它們被認(rèn)為與肌內(nèi)脂肪酸組成相關(guān)的候選基因。

圖1.兩種牛中124個(gè)差異表達(dá)基因熱圖

4.差異表達(dá)基因功能富集分析

為了深入了解西門(mén)塔爾牛和晉南牛肝中差異表達(dá)基因的生物學(xué)關(guān)系，研究人員將差異表達(dá)基因進(jìn)行GO，KEGG富集分析。結(jié)果顯示，?GO生物學(xué)過(guò)程中顯著富集了23個(gè)terms，主要包括催化活性（GO：0043086），脂質(zhì)生物合成過(guò)程（GO：0008610），膽固醇酯化調(diào)節(jié)（GO：0010872），?逆轉(zhuǎn)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)（GO：0043691）和脂蛋白脂肪酶活性的調(diào)節(jié)（GO：0051004）的負(fù)調(diào)節(jié)(P?<?0.05）。?共有4個(gè)KEGG通路被顯著富集（P?<0.05），主要包括造血細(xì)胞譜系（bta04640），細(xì)胞粘附分子（CAMs，bta04514），丙酮酸代謝（bta00620）和T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)通路（bta04660）（圖2）。

圖2.兩種牛的差異表達(dá)基因GO富集中前20個(gè)顯著富集的terms和KEGG通路分析

5.蛋白質(zhì)相互作用分析

為了解西門(mén)塔爾牛和晉南牛肝臟中DEGs的相互作用，研究人員利用Ingenuity?Pathway?Analysis（IPA）軟件進(jìn)行了蛋白質(zhì)?–?蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析。共鑒定了9個(gè)網(wǎng)絡(luò)，?有趣的是，第二個(gè)網(wǎng)絡(luò)與脂質(zhì)代謝，分子運(yùn)輸和小分子生物化學(xué)相關(guān)，該網(wǎng)絡(luò)包括乙酰輔酶A羧化酶β（ACACB），載脂蛋白A1（APOA1），脂肪酸去飽和酶?2（FADS2）和其他脂代謝相關(guān)基因（圖3）。

圖3.兩種牛中差異表達(dá)基因的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

結(jié)論

綜上所述，該研究系統(tǒng)地比較了晉南牛和西門(mén)塔爾牛的肝臟轉(zhuǎn)錄組差異。?總共有124個(gè)被識(shí)別出來(lái)。?與這兩個(gè)品種的IMF沉積差異一致，這些DEGs在脂質(zhì)生物合成和代謝相關(guān)的生物過(guò)程和途徑中富集。?與脂質(zhì)代謝有關(guān)的相互作用網(wǎng)絡(luò)也被確定。?總的來(lái)說(shuō)，該研究提供了與IMF沉積有關(guān)的潛在的候選基因和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這對(duì)于產(chǎn)生更好的肉質(zhì)的牛飼養(yǎng)是有用的。

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創(chuàng)新點(diǎn)

在前期的報(bào)告中有較強(qiáng)IMF沉積能力特征的牛轉(zhuǎn)錄組研究，但是并沒(méi)有兩種不同IMF水平的牛轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。該研究中，使用RNA-Seq方法來(lái)分析兩種不同IMF水平的牛肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。鑒定了差異表達(dá)的基因和相互作用網(wǎng)絡(luò)，這一結(jié)果為牛的肌內(nèi)脂肪酸組成研究奠定了基礎(chǔ)。此外，該研究鑒定的候選基因可能會(huì)對(duì)牛的分子育種有幫助。

 

參考文獻(xiàn)

Xi?W,?Zhang?Y,?Zhang?X,?et?al.?The?comprehensive?liver?transcriptome?of?two?cattle?breeds?with?different?intramuscular?fat?content[J].?Biochem?Biophys?Res?Commun,?2017:1018-1025.