11月29 【成功案例】云平臺(tái)深度解析-小麥與禾谷胞囊線蟲在侵染初始階段的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化

云平臺(tái)深度解析–小麥與禾谷胞囊線蟲在侵染初始階段的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化

Transcriptional responses of wheat?and the cereal cyst nematode?Heterodera?avenae during their?early contact stage

小麥與禾谷胞囊線蟲在侵染初始階段的轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)

雜志：?Scientific Reports?

影響因子：4.259

PMID:29101332

 

研究背景：

植物寄生線蟲（PPNs）已給許多植物帶來了巨大損害。禾谷胞囊線蟲Wollenweber隸屬禾谷胞囊線蟲（CCNS），出現(xiàn)在80％的中國(guó)小麥種植區(qū)，致使小麥感染并減產(chǎn)30％到100％。許多寄生線蟲可繁殖幼蟲，幼蟲用感官定位宿主，這種復(fù)雜的行為與感官能力（如嗅覺、味覺、溫濕度感應(yīng)）有關(guān)?？稍谥参锔颗c線蟲初始接觸過程中采取措施進(jìn)行預(yù)防，因此了解寄生蟲宿主互作機(jī)制具有重要意義。過去大部分研究集中在線蟲侵染宿主后不同階段的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，而沒有關(guān)于侵染前（早期接觸階段）互作機(jī)制的探討。今年11月3日中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所的老師們?cè)赟cientific Reports 發(fā)表了一篇關(guān)于小麥和禾谷胞囊線蟲在接觸早期轉(zhuǎn)錄響應(yīng)機(jī)制的研究，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外研究空白，第一次對(duì)小麥和禾谷胞囊線蟲互作早期轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)性的描述。

 

材料和方法

實(shí)驗(yàn)組：Wenmai19小麥幼苗（根長(zhǎng)2–3 cm ）與J2s；對(duì)照組：僅Wenmai 19小麥幼苗或僅J2s。

處理3h后提取RNA測(cè)序。實(shí)驗(yàn)組小麥根尖染色鏡檢。每組三個(gè)重復(fù)。測(cè)序后分別對(duì)小麥和線蟲DEGs進(jìn)行了鑒定注釋，并對(duì)線蟲的效應(yīng)基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)及BT-PCD驗(yàn)證。

測(cè)序平臺(tái)：百邁客HiSeq4000測(cè)序平臺(tái)

分析平臺(tái)：百邁客云平臺(tái)（BMKCloud）

研究結(jié)果：

1.轉(zhuǎn)錄組分析采樣時(shí)間點(diǎn)確定

CCN易感小麥品種Wenmai19吸引禾谷胞囊線蟲J2s。小麥根尖周圍聚集的J2線蟲數(shù)量在3h達(dá)到峰值，且J2s未滲入根內(nèi)部。選擇此時(shí)小麥根、線蟲樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。

2.小麥根尖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組小麥根尖樣本共得到52.23 Gb的clean reads，每個(gè)樣本≥8.25Gb，Q30≥90.4％。每個(gè)樣品的clean reads與小麥參考基因組比對(duì)效率為64.0％至67.3％，并與唯一或多基因組位置匹配（表1）。小麥轉(zhuǎn)錄組中，共發(fā)現(xiàn)109,496個(gè)unigenes，包括9152個(gè)新基因。與Nr、Swiss-Prot、GO、KEGG、COG等數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，共注釋了6,780個(gè)新基因。數(shù)據(jù)重復(fù)性較好。

表1 小麥參考基因組比對(duì)結(jié)果

3.小麥基因表達(dá)響應(yīng)分析

實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組基因表達(dá)分析得到93個(gè)差異表達(dá)的unigenes（66個(gè)下調(diào)，27個(gè)上調(diào)），F(xiàn)DR<0.05和FC≥1.5（圖1）。對(duì)12個(gè)DEGs進(jìn)行了qPCR驗(yàn)證，其中11個(gè)DEG的表達(dá)模式與mRNA測(cè)序結(jié)果一致。結(jié)果表明即使未受感染，J2線蟲在小麥根部聚集也會(huì)觸發(fā)小麥的響應(yīng)。

圖1 實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組小麥DEGs的火山圖

功能注釋的結(jié)果表明，所有的DEG都能與Nr數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)上，其中一些在Swiss-Prot、GO、KEGG、COG數(shù)據(jù)庫(kù)中也有注釋信息（表2）。

表2 小麥與禾谷胞囊線蟲的DEGs的功能注釋

GO富集分析將小麥DEGs分為28個(gè)功能組，歸為3大類：生物學(xué)過程（60個(gè)）、細(xì)胞成分（54個(gè)）、分子功能（68個(gè)）（圖2a）。

圖2a小麥根尖unigenes 和DEG unigenes的GO分類

在生物過程類別中，與所有小麥根的unigenes相比，大部分DEG與代謝過程、單一生物過程、對(duì)刺激的反應(yīng)相關(guān)。細(xì)胞成分類別中更多DEGs位于細(xì)胞外區(qū)域。 在分子功能類別，與所有unigenes相比，DEG更多富集于營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存活性，抗氧化活性，電子載體活性，酶調(diào)節(jié)活性和催化活性等GO分類。

KEGG通路分析來確定DEGs的生物學(xué)功能。將31個(gè)DEG分配到21個(gè)KEGG通路（圖3a）。最多數(shù)量DEGs歸類于苯丙素生物合成通路，其次是谷胱甘肽代謝，苯丙氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝。6個(gè)DEG與苯丙烷相關(guān)通路有關(guān)，在線蟲侵染的小麥根中全部下調(diào)，其中兩個(gè)基因Traes_1AS_F9013A945和Traes_2AS_EE549925C，經(jīng)qPCR驗(yàn)證有相似的表達(dá)模式。

圖3a.小麥根尖DEGs的KEGG分析

COG注釋后，小麥29個(gè)DEGs被分為6個(gè)COG功能類別，包括能源產(chǎn)生于轉(zhuǎn)換；次級(jí)代謝物合成運(yùn)輸和代謝；僅一般功能預(yù)測(cè)；翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換，分子伴侶；氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝；碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)代謝（圖4a）。

圖4.DEGs的COG功能注釋 a 小麥根系 b禾谷胞囊線蟲

4.小麥DEGs生物脅迫通路圖譜

MapMan分析顯示小麥許多DEGs能比對(duì)到生物脅迫通路（圖5）：29個(gè)小麥DEGs能和生物脅迫通路相關(guān)的33個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)比對(duì)上，DEGs包含過氧化物酶，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶，激素信號(hào)傳導(dǎo)（生長(zhǎng)素和茉莉酸），發(fā)病相關(guān)蛋白和次級(jí)代謝物。這些DEGs大多數(shù)在生物脅迫通路中表達(dá)下調(diào)。qPCR分析其中8個(gè)DEGs，除一個(gè)之外，其他的表達(dá)模式與測(cè)序結(jié)果一致。

圖5.小麥DEGs生物脅迫通路

在氧化還原反應(yīng)通路中，3個(gè)DEGs與過氧化物酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶通路比對(duì)上，且全部下調(diào)，表明氧化還原反應(yīng)減弱。在激素信號(hào)傳導(dǎo)通路中，生長(zhǎng)素和茉莉酸（JA）通路各包含2個(gè)下調(diào)的DEGs。

有7個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)與6個(gè)下調(diào)的DEGs比對(duì)上，幾乎都與苯丙素類黃酮代謝通路有關(guān)。編碼PR蛋白的防御基因有3個(gè)下調(diào)的DEG，1個(gè)下調(diào)的DEG,與細(xì)胞壁蛋白比對(duì)上，1個(gè)表達(dá)上調(diào)的DEG與細(xì)胞壁修飾通路有關(guān)。

2個(gè)下調(diào)的DEG，2個(gè)上調(diào)的DEG可比對(duì)到蛋白酶和泛素相關(guān)蛋白水解通路。

1個(gè)上調(diào)的DEG與突發(fā)性呼吸相關(guān)，隸屬乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白家族的轉(zhuǎn)錄因子，可比對(duì)到Traes_5DL_41E3B1B23基因，是一個(gè)上調(diào)DEG（注釋ERF071）。

5.CCN的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組CNN樣本得到30.47Gb的clean reads，每份樣本≥4.13Gb，Q30≥89.1％。共得到194,662個(gè)轉(zhuǎn)錄本和80,124個(gè)unigenes（表3）。unigenes的總長(zhǎng)、N50長(zhǎng)度、平均長(zhǎng)度分別為61,659,712bp，955bp、769.55bp。長(zhǎng)于1 kb的unigenes有15,197個(gè)。每個(gè)CCN樣本與組裝數(shù)據(jù)的比對(duì)效率在73.2％至79.2％之間。根據(jù)Nr、Swiss-Prot、GO、KEGG、COG、KOG、Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)，共注釋了43741個(gè)unigenes。CCN樣本重復(fù)性良好。

表3 禾谷胞囊線蟲的組裝轉(zhuǎn)錄本及unigene一覽

6.CCN基因?qū)τ谛←湼捻憫?yīng)分析

實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組CNN比較得到879個(gè)DEGs（FDR <0.01和FC≥2）。867個(gè)上調(diào)，僅12個(gè)下調(diào)。對(duì)10個(gè)DEG的表達(dá)模式進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。表明CCNs通過小麥根的刺激激活，大部分基因上調(diào)。

DEGs的功能注釋，GO富集分析把258個(gè)DEGs歸類到三大類的36個(gè)功能組中：生物過程（159個(gè)）、細(xì)胞成分（107個(gè)）、分子功能（223個(gè)）（圖2b）

圖2b 禾谷胞囊線蟲unigenes 和DEG unigenes的GO分類

KEGG分析將247個(gè)DEGs歸到125個(gè)KEGG路徑，50個(gè)最顯著的通路中，核糖體通路有最多的DEG數(shù)（64個(gè)）(圖3b)，其他DEG較多的通路為細(xì)胞色素P450外源物代謝，谷胱甘肽代謝和Toll樣受體信號(hào)通路。表明CNN被小麥根部吸引時(shí)CNN的蛋白翻譯更活躍。

圖3b.禾谷胞囊線蟲DEGs的KEGG分析

共386個(gè)DEGs歸類于22個(gè)COG功能類別。前四個(gè)DEG數(shù)目最多的COG類別為僅一般功能預(yù)測(cè)（90個(gè)）；翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源（65個(gè)）；能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化（45個(gè)）；氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝（44個(gè)）（圖4b）。

7.CNN效應(yīng)基因預(yù)測(cè)

搜集PPNs的351個(gè)已知效應(yīng)子基因序列，并將CCN的DEGs與這些序列進(jìn)行比對(duì)。推測(cè)6個(gè)DEG與已知效應(yīng)基因14-3-3，幾丁質(zhì)酶，β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶，果膠酸裂解酶或組織蛋白酶具有同源性（表4）。比對(duì)上的效應(yīng)基因的描述和DEG的Nr注釋一致。對(duì)這些DEGs結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果也與基因描述一致（圖6，表4）。當(dāng)J2線蟲與小麥根接觸時(shí)，編碼候選效應(yīng)蛋白的DEGs全部上調(diào)。

表4.根據(jù)禾谷胞囊線蟲DEGs預(yù)測(cè)的效應(yīng)基因

圖6 禾谷胞囊線蟲的6個(gè)候選效應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)域

8.效應(yīng)基因的植物防御抑制驗(yàn)證

選擇兩個(gè)預(yù)測(cè)的效應(yīng)基因c68622.graph_c0和c72543.graph_c0，在本氏煙草中進(jìn)行程序性細(xì)胞死亡（BT-PCD）抑制來驗(yàn)證其抑制植物防御的能力。

BAX加入后，在c68622.graph_c0，沒有明顯壞死，而c72543.graph_c0則明顯壞死（圖7）。BT-PCD抑制試驗(yàn)的兩個(gè)重復(fù)結(jié)果一致。表明前者抑制BT-PCD，而后者不抑制。c68622.graph_c0是來自H.avenae DEGs的候選基因，可能在抑制植物防御中發(fā)揮作用。

圖7.（a）c68622.graph_c0和（b）c72543.graph_c0在本氏煙草中BT-PCD的試驗(yàn)

結(jié)論：

本文擬研究在線蟲與小麥根部在早期接觸階段的相互作用機(jī)制，通過mRNA測(cè)序?qū)π←満秃坦劝揖€蟲在接觸早期的轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)進(jìn)行了分析，鑒定了的宿主小麥根部的93個(gè)DEGs（27個(gè)上調(diào)，66個(gè)下調(diào)），寄生線蟲的879個(gè)DEGs（867個(gè)上調(diào)，12個(gè)下調(diào)）。其中一些小麥DEGs（主要是下調(diào)的）與生物脅迫途徑相關(guān)，線蟲DEGs中幾個(gè)推定的效應(yīng)基因表達(dá)上調(diào)，線蟲的幾丁質(zhì)酶樣效應(yīng)基因能抑制本氏煙草中BAX引起的細(xì)胞程序性死亡。以上結(jié)果表明，在寄生初始接觸階段，線蟲的響應(yīng)比小麥更活躍。寄生蟲的響應(yīng)主要與基因（包括至少一個(gè)抗植物防御效應(yīng)基因）的上調(diào)相關(guān)，而宿主響應(yīng)主要與某些防御基因下調(diào)相關(guān)。

 

 

創(chuàng)新點(diǎn)：

第一個(gè)對(duì)小麥和禾谷胞囊線蟲互作早期轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)性描述的研究。

參考文獻(xiàn)：

Chen C, Cui L, Chen Y, et al.?Transcriptional responses of wheat and the cereal cyst nematode Heterodera avenae during their early contact stage[J]. Scientific Reports, 2017, 7:14471.