從GEO數(shù)據(jù)庫中下載得到Y(jié)ing等人上傳的原始測序數(shù)據(jù)（GSE53960）。數(shù)據(jù)集中包含來自32只大鼠的320個(gè)bodymap樣本(每只大鼠包含腎上腺、腦、心臟，腎、肝、肺、骨骼肌、脾臟、胸腺、睪丸或子宮10種不同器官)的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)。Ying等選取了2周、6周、21周和104周四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死雌、雄兩只大鼠，進(jìn)行四次生物學(xué)重復(fù)。

技術(shù)路線：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1.大鼠非編碼基因表達(dá)譜

為了獲得大鼠非編碼基因表達(dá)譜的概覽，作者首先提取了FPKM>0.01?的3,458個(gè)非編碼基因的表達(dá)值，其中54.8%(1,895)是假基因、33.5%(1,158)是miRNA、6.8%?(237)是lncRNA（Fig.1a）。分層聚類分析顯示，非編碼基因的表達(dá)譜明顯按器官類型聚類，比編碼基因表現(xiàn)出更高的器官特異性。PVCA分析發(fā)現(xiàn)在數(shù)據(jù)集中方差貢獻(xiàn)率最多高的是器官（62.94%）（Fig.1b）。在非編碼基因表達(dá)譜的總體方差中年齡（2.82%）貢獻(xiàn)率超過了性別（0.13%）貢獻(xiàn)率（Fig.1d）。

Figure?1.?Expression?profiling?of?noncoding?genes

?2.年齡和性別相關(guān)非編碼基因的差異表達(dá)分析

?利用Cuffdiff對非編碼基因在基因和轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除腎上腺和心臟外雄性大鼠比雌性大鼠共享更多的發(fā)育階段依賴性DEnGs。所有組織中DEnGs的數(shù)目從19（雌性大鼠腦）到503（睪丸）不等（Fig.2a）。腎上腺、心、腎、肝、肌肉和胸腺表現(xiàn)出相當(dāng)數(shù)量的發(fā)育階段依賴性DEnGs，腦和肺中DEnGs的數(shù)量最少。

性別相關(guān)的DEnGs不僅取決于器官，還與年齡相關(guān)。脾臟中性別相關(guān)的DEnGs數(shù)量最多的，而肺中最少，在所有發(fā)育階段中腎上腺和胸腺顯示相當(dāng)一致的DEnGs數(shù)量。在幼鼠的大多數(shù)器官中性別特異性非編碼基因大量表達(dá)，而青春期的大鼠性別特異性的非編碼基因表達(dá)較少。幼鼠大腦中性別相關(guān)DEnGs的數(shù)量最多，這可能與發(fā)育早期大腦快速的發(fā)育速度有關(guān)（Fig.2b）。

Figure?2.?Identification?of?differentially?expressed?noncoding?genes

?3.腦和睪丸中有大量非編碼基因表達(dá)

?當(dāng)比較不同器官對時(shí)，DEnGs的數(shù)量有了很大的變化。四個(gè)發(fā)育階段中腦和肝臟與其他器官相比時(shí)獲得了相對較多的DEnGs。睪丸和胸腺中DEnGs的數(shù)量表現(xiàn)出明顯的年齡依賴性。與其他器官相比，第6和21周的大鼠睪丸中存在最大數(shù)量的DEnGs(Fig.?2c)。

4.共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了注釋大鼠非編碼基因功能，作者構(gòu)建了蛋白編碼基因和非編碼基因之間的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，包含3572個(gè)與年齡相關(guān)的蛋白質(zhì)編碼和非編碼基因，1603性別相關(guān)基因，和16346個(gè)器官相關(guān)的基因。并通過GO分析檢測共表達(dá)分析模塊是否富集在特定的生物學(xué)過程中。

5.年齡相關(guān)的基因共表達(dá)模塊與細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期和免疫系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)

在與年齡相關(guān)的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中，發(fā)現(xiàn)了包含3572個(gè)基因的14個(gè)穩(wěn)定模塊（Fig.?3c）。藍(lán)色的模塊包含1151個(gè)基因（其中有60個(gè)非編碼基因）被顯著富集到諸如細(xì)胞周期過程，細(xì)胞分裂，有絲分裂，以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和RNA代謝調(diào)節(jié)GO條目中。這些條目富集結(jié)果說明發(fā)育差異與生長發(fā)育過程中的代謝變化和基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)。通路分析顯示細(xì)胞周期和堿基切除修復(fù)相關(guān)基因被顯著富集，提示細(xì)胞周期和自我修復(fù)功能可能受老化影響。其他模塊如棕色和綠色顯示出另一個(gè)免疫系統(tǒng)相關(guān)的富集趨勢，如免疫反應(yīng)、免疫系統(tǒng)發(fā)育和淋巴器官發(fā)育。很多腦、脾臟和胸腺中的年齡相關(guān)基因與癌癥和其他年齡相關(guān)疾病關(guān)聯(lián)，這提示衰老可能是通過影響免疫系統(tǒng)導(dǎo)致這些疾病的發(fā)生。其他基因主要涉及幫助免疫系統(tǒng)抵御炎癥和轉(zhuǎn)移白細(xì)胞以建立機(jī)體的防御系統(tǒng)。最后，粉紅色模塊中的七個(gè)非編碼基因與骨骼系統(tǒng)的發(fā)育有關(guān)。

Figure?3.?Co-expression?network?construction?on?age-related?genes.

本文還利用相同的方法構(gòu)建了器官相關(guān)和性別相關(guān)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示器官相關(guān)模塊很大程度上取決于不同組織類型的功能，性別相關(guān)模塊中包含性別發(fā)育相關(guān)基因。

6.年齡相關(guān)棕色模塊的可視化分析顯示樞紐編碼基因在網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)節(jié)作用

作者通過關(guān)聯(lián)3,572個(gè)年齡相關(guān)基因中的特征向量基因研究模塊和年齡之間的關(guān)系（Fig.4a），毗鄰關(guān)系反應(yīng)模塊的相關(guān)性。包含許多非編碼基因的棕色模塊與年齡有相對緊密的關(guān)系。因此選取了此模塊中189個(gè)與衰老相關(guān)的基因（包括七個(gè)非編碼基因，閾值為0.32）進(jìn)行進(jìn)一步的網(wǎng)絡(luò)可視化分析，獲得了兩個(gè)主要的集群，其中有幾個(gè)中心基因連接著相鄰基因。雖然非編碼基因不在網(wǎng)絡(luò)的中心，但是七個(gè)大鼠的非編碼基因與免疫系統(tǒng)相關(guān)基因共同參與網(wǎng)絡(luò)運(yùn)作。

Figure?4.?Network?visualization?of?age-related?brown?module.

結(jié)論：利用大鼠bodymap?RNA-seq數(shù)據(jù)構(gòu)建了大鼠4個(gè)發(fā)育階段、11個(gè)組織中的3,458個(gè)非編碼基因的表達(dá)譜。構(gòu)建了一個(gè)推斷蛋白質(zhì)非編碼基因生物學(xué)功能的編碼和非編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，年齡相關(guān)模塊被富集到免疫系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)條目。年齡相關(guān)棕色模塊的可視化分析發(fā)現(xiàn)大鼠非編碼基因與免疫系統(tǒng)相關(guān)基因共同參與網(wǎng)絡(luò)運(yùn)作。

創(chuàng)新點(diǎn)：本文提供了一個(gè)鑒定和注釋大鼠非編碼基因的模型，涉及到多個(gè)器官和雌雄兩性的不同發(fā)育階段。建立了一個(gè)全面、可靠的推斷多個(gè)器官之間隨發(fā)育變化的非編碼基因表達(dá)平臺(tái)，為以后大鼠中非編碼基因表達(dá)譜研究奠定了基礎(chǔ)。