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09月01 【成功案例】云平臺助力爪蟾卵母細(xì)胞m6A修飾mRNA功能研究

發(fā)布于 11:26 作者： bmk

分子生物學(xué)的中心法則中，遺傳信息從DNA傳遞給RNA再流向蛋白質(zhì)，此過程中RNA不僅發(fā)揮遺傳信息傳遞的作用，還負(fù)責(zé)調(diào)控各種生物學(xué)過程。早在40年前研究者就發(fā)現(xiàn)mRNA存在類似于基因組DNA和組蛋白上可逆的表觀遺傳修飾（其中N6-methyladenosine m6A是最常見的一種轉(zhuǎn)錄后修飾，介導(dǎo)了超過80%的RNA堿基甲基化），但當(dāng)時并不清楚RNA這種修飾的具體功能，隨著近期研究的深入逐漸揭開了mRNA甲基化的神秘面紗，它可以參與調(diào)控基因表達(dá)，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化和發(fā)育。對mRNA甲基化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的分析當(dāng)然離不開便捷、可靠的數(shù)據(jù)深度挖掘工具啦！近期百邁客云平臺Blast小工具助力孫青原老師關(guān)于m6A參與調(diào)節(jié)爪蟾卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟和胚胎發(fā)育的文章發(fā)表于“Journal of biological chemistry”雜志。接下來，小編跟大家分享這篇文章。

N6-methyladenosine seqencing highlights the involvement of mRNA methylation in oocyte meiotic maturation and embryo development by regulating translation in Xenopus laevis

N6-甲基腺苷測序揭示mRNA甲基化通過調(diào)節(jié)非洲爪蟾的翻譯水平參與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟和胚胎發(fā)育

PMID: 27613873

雜志：Journal of biological chemistry (JBC)

影響因子：4.12

研究背景

在動物（如爪蟾、小鼠）的卵子發(fā)生過程中，生殖泡（GV）期卵母細(xì)胞達(dá)到最大體積，同時基因組轉(zhuǎn)錄活動被沉默。成熟的GV期卵母細(xì)胞重新開始分裂、發(fā)育到第二次減數(shù)分裂中期（MII期）后卵母細(xì)胞與精子結(jié)合形成受精卵，受精卵開始分裂起始胚胎發(fā)育，直到中囊胚期全基因組轉(zhuǎn)錄活性恢復(fù)。因此，卵母細(xì)胞生長過程中積累的母源mRNAs的翻譯應(yīng)得到精確的調(diào)控。近期的研究證據(jù)揭示修飾（m6A）參與調(diào)解mRNA翻譯，且m6A修飾在mRNA的不同區(qū)域會產(chǎn)生不同的翻譯修飾效應(yīng)。目前，m6A修飾是否參與非洲爪蟾卵母細(xì)胞翻譯調(diào)控，及其在卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育中的扮演的角色還不清楚。

材料方法

1.實驗材料：

GV期和MII期爪蟾卵母細(xì)胞。

2.測序方法：

提取GV期和MII期爪蟾卵母細(xì)胞總RNA后分別進(jìn)行m6A-seq測序。

技術(shù)路線
實驗結(jié)果
1. GV期和MII期爪蟾卵母細(xì)胞的m6A-seq

對GV期和MII期爪蟾卵母細(xì)胞的m6A修飾mRNAs進(jìn)行分離和測序分析后與X. laevis轉(zhuǎn)錄組比對，鑒定了4207條甲基化修飾的mRNAs（GV期4128條；MII期3820條）。根據(jù)m6A峰的高度，作者把這些mRNAs分為三類：高m6A mRNAs、中m6A mRNAs和低m6A mRNAs。通過這些結(jié)果發(fā)現(xiàn)從GV期到MII期有1674個mRNAs保持甲基化修飾水平，此外有2400條mRNAs的m6A水平下降、133條mRNAs的m6A水平升高(Figure 1A)。

利用m6A峰值對應(yīng)序列，作者預(yù)測了爪蟾中保守的m6A基序。與人和小鼠中相似，爪蟾中mRNA甲基化也發(fā)生在GGACU基序(Figure 1B)。研究還發(fā)現(xiàn)m6A峰主要分布在編碼DNA序列（CDS）的下游位置的CDS末端位點附近(Figure 1C)。

?Figure 1. Summary of the m6A modified mRNAs in X. laevis oocytes.
2. 爪蟾中甲基化mRNAs相關(guān)通路的基因集富集分析

為了研究RNA甲基化是否參與卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育，作者利用DAVID工具對m6A修飾mRNA進(jìn)行了KEGG通路分析。結(jié)果高或者中等甲基化的mRNAs主要富集在ErbB、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟和細(xì)胞周期等通路中。但是，低甲基化的mRNAs主要被富集在RNA降解、DNA復(fù)制、核糖體、剪接體、磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑相關(guān)通路中。

為了進(jìn)一步評估這些m6A修飾在非洲爪蟾卵母細(xì)胞的生物學(xué)功能，作者利用biocloud平臺的BLAST工具對爪蟾mRNAs進(jìn)行了注釋(powerwashservicesinc.com)。GO注釋的結(jié)果顯示，卵母細(xì)胞m6A甲基化mRNAs主要與生物學(xué)過程有關(guān)，如：轉(zhuǎn)錄、蛋白磷酸化和細(xì)胞分裂。

3. mRNAs甲基化與蛋白翻譯間的關(guān)系

為了探索mRNAs甲基化是否與翻譯有關(guān)，作者把mRNA甲基化數(shù)據(jù)與Smits等人已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合。通過BLAST分析，在RNA/蛋白數(shù)據(jù)中找到了723個m6A修飾mRNAs的信息。GV期或者M(jìn)II期卵母細(xì)胞中高m6A峰的RNA水平（log10 RNA RPKM值）比總RNA高（在卵或者胚胎中），但是蛋白水平（log10 protein amount / fmol）比總蛋白水平低（Figure 2）。與高度甲基化的mRNAs相比，低甲基化RNAs顯示出非常高的表達(dá)水平（Figure 3）。這些結(jié)果說明在卵母細(xì)胞或早期胚胎中，m6A修飾可能與mRNA翻譯有關(guān)。

Figure 2. Scatter plot of the m6A modified mRNAs in the transcriptome/proteome data.
Figure 3. Box plot of the RNA levels and protein levels of m6A modified mRNAs.
為了分析mRNA甲基化的位置（5UTR, CDS和3UTR）與翻譯的關(guān)系，作者提取了GV期卵母細(xì)胞5UTR、5’末端CDS、3’末端CDS或者3UTR位置高度甲基化的mRNA信息（Figure 4）。結(jié)果顯示5CDSs或3CDSs甲基化的mRNAs顯示出較低的蛋白表達(dá)水平。此外，3UTR甲基化的mRNAs顯示出較高的蛋白表達(dá)水平。這些數(shù)據(jù)說明CDS區(qū)域RNA甲基化可能抑制mRNA翻譯。
Figure 4. The RNA levels and protein levels of hypermethylated mRNAs in GV oocytes.
結(jié)論：在爪蟾GV期和MII期的卵母細(xì)胞中鑒定了4207個甲基化的mRNA。整合mRNA甲基化數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和蛋白組數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，盡管RNA水平?jīng)]有顯著差異，高度甲基化的mRNAs與低甲基化的mRNAs相比顯示較低的蛋白表達(dá)水平。研究還發(fā)現(xiàn)低甲基化的mRNAs主要富集在細(xì)胞周期和翻譯信號通路中，而高甲基化水平的mRNAs主要與蛋白磷酸化有關(guān)。本文結(jié)果表明卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟與早期胚胎發(fā)育時期的mRNA甲基化可以調(diào)節(jié)翻譯和細(xì)胞分裂。